杭州大微：厌氧微需氧微生物培养工具进展

  8月18日至19日，第十三届全国微生物资源学术研讨会在湖北武汉顺利召开。杭州大微生物技术有限公司张帆总经理作为会议嘉宾受邀参加。作为国内专业、领先的厌氧菌/微需氧菌培养、检验测试整体解决方案的供应商，杭州大微生物的张帆总经理围绕厌氧菌/微需氧菌培养工具的发展历史和公司核心产品在微生物培养组学领域中的多重应用，进行了标题为《厌氧微需氧微生物培养工具进展》的主题演讲。

  在研讨会演讲过程中，张帆总经理首先从厌氧/微需氧微生物的发现与历史、研究的重要性和难点、检测及培养手段的发展历史等方面做了精彩的介绍。

  根据微生物对氧气的利用和耐受程度的不同，科学家将它们分为好氧、微需氧、严格厌氧、兼性厌氧和耐氧微生物。

  19世纪60年代，法国科学家路易斯·巴斯德开启了厌氧微生物学研究。他首次根据微生物是不是能够在有氧条件下生长，将微生物划分为好氧和厌氧微生物，并于1877年分离出了致病性厌氧菌—腐败梭菌，从此拉开了厌氧微生物研究的序幕。

  在当时,巴斯德研究厌氧菌的过程中，使用了很多方法去分离、培养厌氧菌，他曾采用烛缸法、煮沸法以及抽气法来制造出厌氧环境，都成为主流的厌氧操作技术。但这一些方法受制于当时的技术发展，并不能生成严格的厌氧环境。

  除此以外，在厌氧培养的时候，还需采用深层琼脂/液体培养基进行培养，并结合液封或者橡胶塞、密封罐等方式密封。这一些方法沿用至今，但它们难以真正隔绝氧气，而且在挑取深层单菌落的过程中也容易被污染。

  在过去，人们认为巴斯德点（氧分压达到当前大气氧分压水平的1%，大约94μmol/L）是好氧和厌氧微生物生长的分界点，然而这一论点由于脆弱拟杆菌的发现被推翻，由于脆弱拟杆菌需要利用nmol/L级的氧气生长，因此这对厌氧培养工具提出了更严格的要求。

  与此同时，美国微生物学家Robert E. Hungate在1944年对牛瘤胃中纤维素降解微生物进行研究时，他所提出的滚管法成功培养了纤维梭菌。经过逐渐完备，该方法已成为厌氧微生物分离培养的经典方法。

  20世纪70年代，商品化厌氧产气袋在日本诞生，其基础原理是将密闭空间中的氧气完全或者部分吸收，同时产生二氧化碳。产气袋操作简单便捷、应用场景范围广，经济且针对性强，直至今天仍然是很多实验室入门级的研究工具。

  1975年，英国Electrotek（依莱泰科）制造了全球首台厌氧手套箱，这是迄今为止国际上公认的厌氧菌培养的优秀仪器之一，在分离接种环节能提供厌氧保护，并通过内置方式提供相对精确的温控系统，以实现微生物培养；同时在培养过程中，透过玻璃可直接观察微生物生长情况并集合其配套的手套可及时进行二次分纯。

  20世纪80年代，基于Maclntosh和Flides气体替换法的厌氧培养系统在欧洲诞生，主要原理是采用气体抽排置换方法来制造培养气体环境。

  直到2003年，荷兰Anoxomat公司推出MARK品牌厌氧培养系统。2008年，杭州大微将这项技术实现国产化，并结合市场需求开发出首代的DW 100A-K智能厌氧微生物培养系统，并在之后的技术发展和需求更迭的过程中一直更新完善。

  当前，新新一代DW 100A-K智能厌氧微生物培养系统主要的特点为智能控气与智能密封。空气与无氧混合气的交互置换仅通过一根气管进行，进而达到严格的气体密封环境。同时通过每次实验前对密封罐体漏气点的自动检验测试确保密封性，实现对系统的精确质控，保证实验结果的准确性。

  受益于培养系统的腔体大小，培养系统里的厌氧环境生成速度与手套箱相比明显加快，避免了厌氧微生物样品长时间暴露在相对较高浓度的氧气环境，以达到保护微生物资源的目的。

  DW 100A-K智能厌氧微生物培养系统简单易操作，通过菜单选择目标氧气浓度，一键启动，全程自动化；当我们在做肠道菌群研究时需模拟肠道环境，在无法知晓微生物适宜培养条件下，可利用仪器设置不同培养环境，平行对比培养结果。

  系统使用时，仅需把培养物放入罐体，将密封罐体与主机相连（主机连接无氧气的混合气瓶），通过在菜单上选择厌氧或特定氧气浓度，选择完毕之后一键确认启动，系统即可自动完成抽真空、压力控制、氧气浓度控制、密封性测试等一系列操作，4min即可达到厌氧环境，2min即可达到微需氧环境。随后机器自动提示，此时可将罐体与机器脱离，并将培养罐放入恒温箱内培养。

  DW 100A-K智能厌氧微生物培养系统培养罐体规格多样，从放置6皿到40皿所需的培养罐均有配置，可同时实现不同样本类型、不一样的温度、不同环境的同时培养。

  目前，DW-100A-K智能厌氧微生物培养系统在多个领域得到应用，适用于各类厌氧微生物培养、致病菌风险监测、益生菌培养研究、微生物培养组学等诸多领域，并已得到应用验证。

  2020年，中国海关科学技术研究中心对DW-100A-K智能厌氧微生物培养系统效果做验证，结果显示：该系统操作简单便捷，培养效果良好，运行成本低，无耗材。

  在专题演讲的尾声张帆总经理引用了2019年Nature Reviews Microbiology中一篇文章，文中提到地球上超过70%的微生物分布在陆地和海洋深部缺氧沉积物中，这表明地球上的微生物仍然以厌氧微生物为主。因此，DW-100A-K智能厌氧微生物培养系统也将持续成为厌氧微生物培养的重要手段和工具。

  作为国内先进的微生物检验测试仪器制造商，杭州大微接下来将在两个方面推进在厌氧微生物领域的研究：

  一是针对各种厌氧菌基于MALDI-TOF平台制备厌氧微生物数据库，届时杭州大微将与伙伴实验室展开合作，建立共享机制，提升在培养组学中微生物蛋白图谱的数据累积；

  二是对传统厌氧手套箱做改造，在内放置酶标板，实现厌氧环境下高通量96孔板或384孔板的培养，以提升微生物分离率；同时在现有基础上尝试将流式细胞仪放入专用厌氧手套箱。

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