补骨脂为豆科植物补骨脂 Psoralea corylifolia L. 的干燥成熟果实，温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻，用来医治肾阳不足、阳痿遗精、遗尿尿频、腰膝冷痛、肾虚作喘、五更泄泻；外用消风祛斑，治疗白癜风、斑秃 [1] 。补骨脂始载于《雷公炮炙论》，临床应用历史悠远长久广泛，据药智数据库统计，含补骨脂的中成药方剂有 224 种，保健食品达 52 种。补骨脂常作为传统补益类中药，亦为骨伤科要药，但近年来含补骨脂的复方制剂如骨康胶囊、仙灵骨葆口服制剂等的肝损伤风险引起关注 [2-3] 。合理配伍使用是其临床应用安全有效的重要手段。 武文星等 [4] 采用数据挖掘分析了补骨脂的配伍特点，杜仲是与补骨脂配伍的第 4 位高频药味， 2 味药物配伍组合中支持度最高的为补骨脂 - 当归（ 28.61% ）和补骨脂 - 杜仲（ 28.44% ）。青娥丸为杜仲配伍补骨脂的代表补肾良方，首载于宋代《太平惠民和剂局方》，现收载于《中国药典》 2020 年版一部，且未见临床肝损伤相关不良反应报道，探讨补骨脂 - 杜仲配伍减毒作用对临床安全用药具有意义。
课题组前期用斑马鱼高效筛选验证杜仲为补骨脂配伍减毒的较优药味，并探讨了代表成分桃叶珊瑚苷对补骨脂素（ psoralen ， PS ）的减毒作用 [5] 。 补骨脂化学成分复杂，主要含香豆素类、黄酮类和单萜酚类，其中香豆素类包括苷元 [ 以 PS 和异补骨脂素（ isopsoralen ， IPS ）为代表 ] 及其糖苷 [ 补骨脂苷（ psoralenoside ， PSS ）和异补骨脂苷（ isopsoralenoside ， IPSS ）为代表 ] ，是抗骨质疏松的主要活性成分 [6-7] ，也是补骨脂水煎液中主要成分（约为香豆素类、黄酮类和单萜酚类 3 类成分含量之和的 90% 以上），其中糖苷含量约是苷元的 8.2 倍 [8] 。近年研究表明，香豆素是补骨脂潜在肝损伤风险成分之一， PS 和 IPS 都能对大鼠的肝脏系数造成一定负面影响且会引起丙氨酸代谢、甘氨酸代谢、尿素循环等通路的混乱，还可能通过抑制胆汁酸在肝脏中的排泄，使得毒素大量堆积在肝细胞中，引发肝损伤 [9-11] 。体内代谢转化至关药物的效 / 毒产生，补骨脂糖苷成分可脱糖基转化成苷元使毒性增加 [12] 。因此，关注杜仲配伍后补骨脂香豆素类特别是糖苷成分的代谢及效 / 毒的多模态变化，对揭示杜仲补骨脂配伍特性与机制具有意义。
中药成分特别是量微成分的抗骨质疏松活性、毒性和代谢的在体、高效评价一直是哺乳动物试验难以克服的瓶颈。新兴的模式动物斑马鱼遗传生物特性与人类高度保守，并几乎具备人体所有主要的器官和系统，体型小，繁殖能力较强且易于饲养，适合大规模筛选 [13] 。课题组前期建立斑马鱼骨质疏松模型和代谢等方法，实现多种壮骨中药及其量微成分的代谢与效 / 毒的多模态高效评价 [14-15] 。 本研究采用斑马鱼进行代谢、毒性、抗骨质疏松活性的多模态评价，探讨杜仲富含木脂素提取物（ lignan extract of Eucommiae Cortex ， LEEC ）与补骨脂香豆素提取物（ coumarin extract of Psoraleae Fructus ， CEPF ）配伍以及各自代表成分配伍，对香豆素提取物及代表糖苷的代谢转化及效 / 毒影响，以揭示二药配伍的特性。
斑马鱼成鱼购自南京尧顺禹生物科技有限公司，为德国 Tuebingen 品系。
盐补骨脂（产地为四川，批号 201019 ，南京松龄中药饮片有限公司）、盐杜仲（产地为贵州，批号 20210902-01 ，贵州同德药业有限公司）由江苏省中西医结合医院采购，以上药材经江苏省中医药研究院韦英杰研究员分别鉴定为豆科植物补骨脂 P. corylifolia L. 的干燥成熟果实、杜仲科植物杜仲 Eucommia ulmoides Oliv. 的干燥树皮；对照品 PSS （批号 210306 ，质量分数＞ 98% ）、 IPSS （批号 200930 ，质量分数＞ 98% ）购自上海融禾医药科技有限公司；对照品 PS （批号 11 ，质量分数为 99.6% ）、 IPS （批号 11 ，质量分数为 99.4% ）购自中国食品药品检定研究院；对照品松脂醇二葡萄糖苷（ pinoresinol diglucoside ， PDG ，批号 20011401 ，质量分数为 98.64% ）购自成都普菲德生物技术有限公司； LEEC 为课题组自制， PDG 质量分数为 4.02% ； CEPF （批号 D191021-3 ）为课题组自制， PS 、 IPS 、 PSS 、 IPSS 质量分数之和为 68.17% ；茜素红（批号 K08J9C63243 ）、依替膦酸二钠（批号 K22A8M34493 ）购自上海源叶生物科技有限公司；色谱级乙腈（批号 20095191 、 22035238 ）购自阿拉丁试剂有限公司、美国天地试剂公司；色谱级甲酸（批号 G1826012 ）购自阿拉丁试剂有限公司；龙（批号 FD050193 ，质量分数为 98% ）购自萨恩化学技术上海有限公司；多聚甲醛（批号 20140901 ）购自上海展云化工有限公司。
2.2.2 斑马鱼给药 胚胎由斑马鱼成鱼自由交配产生，将胚胎放置培养基中，在 28.5 ℃培养箱中培养 24 h 。取受精后 1 d （ one day after fertilization ， 1 dpf ）的斑马鱼胚胎置 24 孔板中，每孔 10 个胚胎， 30 个胚胎 / 组，分别暴露于不同质量浓度的供试液中，每孔 2 mL 溶液，用培养基作空白对照。每天记录死亡鱼数，于显微镜下观察鱼的形态，并于 3 dpf 或 3 ～ 6 dpf 时于显微镜下拍照，一直记录到 6 dpf 。
2.3.2 样品处理 将上述给药后 0 ～ 5 d 代谢液、空白药液，室温空气吹干，加 80% 甲醇 1 mL 溶解，进样 20 μL ，进行 HPLC 分析。
（2）依替膦酸二钠溶液配制：精密称取依替膦酸二钠 6 mg ，加入培养基 1 mL 溶解，得 6 mg/mL 依替膦酸二钠储备液。取依替膦酸二钠储备液和龙储备液适量，用培养基稀释得含 25 μmol/L 龙的 30 μg/mL 依替膦酸二钠溶液。
2.4.2 斑马鱼分组与给药 将 3 dpf 的斑马鱼胚胎放入 24 孔板中，每孔 10 个胚胎，每组 20 个胚胎，设置 0.4% DMSO 溶媒对照组、模型组（ 25 μmol/L 龙）、阳性药物组（ 30 μg/mL 依替膦酸二钠）及各供试液组，每孔加入各质量浓度溶液 2 mL 。将 24 孔板放入 28.5 ℃恒温培养箱中培养 5 d ，隔天换 1 mL 新溶液，培养至 8 dpf 。
2.4.3 斑马鱼幼鱼的固定、骨骼染色与分析 斑马鱼幼鱼培养至 8 dpf ，用 4% 多聚甲醛处死固定过夜后，采用 1% KOH 配制的含 1.5% H2O2 漂白剂将鱼体漂白后，用茜素红对斑马鱼幼鱼头部骨骼染色，最后用 1% KOH- 甘油（ 1 ∶ 1 ）的透明液清洗，去除多余的染色剂。用 Image pro plus 6.0 软件计算头骨染色矿化面积和累积吸光度值。
2.4.4 数据分析 用 Excel 软件统计分析头骨染色矿化面积和累积吸光度值数据，计算各组数据的平均值、标准偏差以及变异系数（ n ＝ 15 ～ 20 ），以 t -test 比较两组间的结果差异；运用 SPSS 16.0 软件以单因素方差分析多组间结果比较，方差齐性时用最小显著性差异法（ LSD ）进行组间两两比较，方差非齐性时用 Dunnett’s T3 法进行组间两两比较。
3.1.1 LEEC 配伍 CEPF 及二者代表成分配伍对斑马鱼致畸作用的影响 斑马鱼受精 3 dpf 后孵化成幼鱼，各脏器发育基本完全，鱼体透明，在载玻片上易侧卧，显微镜下检视脏器形态清晰、直观。对 3 dpf 或 3 ～ 6 dpf 斑马鱼幼鱼进行动态检视并拍照，如图 1 所示， 与对照组比较， CEPF （ 600 、 800 μg/mL ）组鱼出现心包肿大，卵黄囊肿大、变黑； LEEC （ 100 ～ 800 μg/mL ）组鱼未见明显心包、卵黄囊等形态畸变；二者不同比例（ CEPF ∶ LEEC 为 1 ∶ 4 ～ 2 ∶ 1 ）配伍后，鱼主要器官心包、卵黄囊畸变与 CEPF 的剂量相关，当 CEPF ∶ LEEC 为 1 ∶ 4 和 1 ∶ 2 时， 100 ～ 800 μg/mL 给药组鱼未见明显心包、卵黄囊等形态畸变；当 CEPF 所占比例增加， CEPF ∶ LEEC 为 1 ∶ 1 和 2 ∶ 1 时， 600 、 800 μg/mL 给药组鱼出现心包肿大、卵黄囊肿大或变黑，有时鱼体弯曲。提示 LEEC 在适当质量浓度时可改善 CEPF 引起的斑马鱼主要器官畸变。
补骨脂香豆素代表成分 PSS 、 IPSS ，杜仲木脂素代表成分 PDG 及配伍各质量浓度组 3 dpf 斑马鱼心包、卵黄囊等形态未见明显变化（图 2 ），提示此时各药物尚未使鱼明显致畸，与此时无鱼死亡结果相对应。随着给药时间增加到 5 ～ 6 dpf 时， 400 ～ 500 μg/mL PSS 、 IPSS 及配伍组鱼出现死亡，且 500 μg/mL PSS 或 IPSS 组鱼产生非常明显畸变，如鱼身体弯曲，鱼鳔消失；配伍 PDG 后，鱼形态均显著改善，与培养基组鱼相当。
LEEC 与 CEPF 及代表成分配伍经斑马鱼作用后 0 ～ 5 d 的 HPLC 图见图 5 。以补骨脂香豆素糖苷（ PSS 、 IPSS ）及其代谢物（ PS 、 IPS ）为指标，计算各自占 4 种香豆素成分含量总和的百分比计为相对质量分数 [12] ，结果见图 6 。
近年来，含补骨脂相关制剂引起的肝损伤不良反应受到关注，配伍减毒是其临床安全用药的有效手段。源于宋代《太平惠民和剂局方》的青娥丸以杜仲 - 补骨脂药对为君药和臣药，临床用药安全有效，故研究杜仲配伍补骨脂的减毒作用有代表性，为补骨脂临床安全配伍用药提供参考。
药物的毒 / 效产生与其在体内的代谢转化紧密相关，故考虑代谢- 效/ 毒的变化能更好体现药物配伍的整合作用。而采用活体动物实验是确定药物的有效性与安全性的必需环节。怎么来实现高效、规模化的评价至关重要，近年来斑马鱼因遗传特性与人类高度保守等优点而被大范围的使用在探索药物药理、毒理及代谢等研究，此外斑马鱼易于饲养，繁殖能力较强，体外受精卵发育迅速，主要器官在受精后5 d 均已基本形成，头骨在受精后8 ～9 d 也已发育完整，幼鱼全身透明，适合显微镜下实时动态观察，体小适合微板中实验，实现大规模筛选[17-18] 。
广义上讲，模态是指通过不同渠道和媒介获得的模式数据或符号系统，包括文字、图像、视频、声音甚至知识图谱。而 2 种以上模态的交叉或者一种模态下多类测量指标的融合均可称为多模态。多模态在药物筛选、多模态影像、多模态单细胞组学等方兴未艾[19] 。张伯礼院士团队[19] 从中医药整体观出发，提出中药药效物质多模态辨识，指综合运用化学分析、影像学、多组学以及信息学等学科技术，在微观、介观、宏观等多个尺度辨析中药化学组成与生物效应间的相关性，并运用模式识别、机器学习等智能计算方式融合多模态信息，从而辨识中药药效物质及其整合调节作用。斑马鱼模型具有活体成像优势，对1 个或多个图像指标进行观测，结合分子生物学变化，慢慢的变多地用于多模态水平开展中药药效物质研究[20] 。本研究整合斑马鱼活体成像，头骨染色图像、致死量、成分转化等多指标分析，实现反应代谢- 毒/ 效的多模态评价。
以糖苷（ PSS 和IPSS ）为代表的补骨脂香豆素类成分是其传统水煎液的主要成分，故本研究探讨LEEC 配伍CEPF 及二者代表成分配伍后的代谢、毒性及抗骨质疏松活性变化，以期揭示二药配伍的机制。 斑马鱼毒性评价发现，CEPF 单独用药致斑马鱼的死亡率和致心包、卵黄囊等形态畸变均大于LEEC ，200 ～800 μg/mL CEPF 致鱼死亡主要在给药72 ～120 h （4 ～6 dpf ）逐渐增加，二者不同比例组合后，随着LEEC 的占比增加（50% ～80% ），致鱼死亡质量浓度（600 ～800 μg/mL ）较CEPF 单用提高，死亡时间延迟约24 h ，死亡率也相应降低，且6 dpf 斑马鱼的LC50 值相应慢慢地提高，提示具减毒作用。杜仲木脂素代表成分PDG 配伍补骨脂香豆素代表糖苷PSS 和IPSS 致斑马鱼死亡具有相似减毒结果，给药120 h 后，明显降低PSS 或IPSS （400 、500 μg/mL ）组鱼死亡率（最高降低56.7% ），6 dpf 的LC50 值也分别增加。
斑马鱼代谢研究发现， CEPF 单独给予1 dpf 斑马鱼，主要成分PSS 和IPSS 在给药后4 d （5 dpf ）代谢速率显著增加，分别全部脱糖基转化为PS 和IPS ，配伍LEEC 后，PSS 和IPSS 代谢速率明显减慢，直至给药后5 d （6 dpf ）才全部转化为PS 和IPS 。同样杜仲木脂素成分PDG 配伍可减慢PSS 和IPSS 的代谢速度。PS 和IPS 是补骨脂肝损伤相关成分[21-23] ，补骨脂CEPF 及PSS 和IPSS 致鱼死亡或畸变与代谢物PS 和IPS 的产生紧密关联，杜仲LEEC 及PDG 配伍使PS 和IPS 产生减慢，是减毒的重要因素。
用龙诱导斑马鱼骨质疏松模型评价，以 8 dpf 斑马鱼头骨矿化面积和累积吸光度值为指标，根据结果得出，LEEC 配伍CEPF （0.5 、2.5 μg/mL ）组的累积吸光度值明显高于相同质量浓度CEPF 和/ 或LEEC 单独给药。PDG 配伍PSS 或IPSS （0.4 、2.0 μg/mL ）组累积吸光度值明显高于PSS 或IPSS 单独给药。斑马鱼头骨累积吸光度值相当于骨质疏松评价金指标“骨密度”，可见上述配伍组合有一定增强抗骨质疏松活性的作用。
综上，用斑马鱼评价发现杜仲配伍对补骨脂香豆素类成分的代谢、毒性及抗骨质疏松活性的多模态变化，发现配伍使糖苷转化为毒性苷元的速度减慢与减毒作用相关，配伍尚能增强抗骨质疏松活性。该方法对中药配伍的效 / 毒作用起到了快速与精准的辨识，为评价壮骨中药配伍组合的减毒增效作用提供了有意义的方法与构想。
来 源：高一波，李佳妍，石子琪，宁 青，韦英杰．基于斑马鱼多模态评价杜仲配伍补骨脂对其香豆素成分的代谢及毒/效影响 [J]. 中草药, 2023, 54(5):1449-1460.
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