原发性肝癌是我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因，其中约90%为肝细胞癌[1]。肝癌的发生、发展机制复杂，涉及多个原癌基因以及信号通路[2]。近年来，中药在肝癌的预防、控制转移与复发等方面所具有的优势，使其成为抗肝癌新药研发的热点和方向[3-5]。目前中医药界对于肝癌的理论及治疗研究逐渐增多，并形成了较为统一的认识，其病机在于气虚血瘀，其治法以益气活血为主[6]。黄芪-莪术是益气活血法代表性药对，源于张锡纯所著《医学衷中参西录》中的理冲汤，主治气虚血瘀证[7]。从中医理论讲，黄芪味甘性微温，可补气升阳，为“补中益气之要药”[8]；莪术辛散苦泄，能破血散瘀，又能行气化积，是“破血化瘀之重药”[9]；两药配伍使用“破中有补，补中有行，相得益彰”进而达到“补而不滞”之效，为益气活血配伍的典型代表[10]。孙桂芝教授擅用桃红芪术软肝煎起益气活血之效，认为黄芪-莪术配伍治疗肝癌时能够补脾胃、破癥消积，对肝癌有很好的抑制作用，在临床实践中运用此法与化疗联合使用，能够显著改善肝癌患者的生存质量，在提高肝癌远期疗效上具有一定优势[11-13]。黄芪-莪术药对配伍治疗肝癌的作用确切，在抗肝癌中药中具备极其重大地位，但是黄芪-莪术药对抗肝癌的配伍机制尚不明确。本研究整合生物信息学与网络药理学预测黄芪-莪术药对治疗肝癌的相关靶点和通路，将筛选得到的核心成分与靶点进行分子对接，探究黄芪-莪术药对的多成分、多靶点、多通路的配伍协同作用机制，并采用体外细胞实验对核心成分和靶点做验证。系统研究黄芪-莪术药对抗肝癌配伍机制，不仅可为含有该药对的抗肝癌系列类方的研究提供参考，而且有利于指导中医临床的合理用药，同时为该类方的质量控制和新药研发提供重要的科学依据，为肝癌这一发病率日趋升高、严重威胁人类健康的重大疑难疾病治疗做出贡献。
人肝癌 HepG2 细胞、人正常 LO2 肝细胞购自中国科学院上海细胞库。
2.1.3 黄芪、莪术化学成分收集及潜在活性成分筛选 在 TCMSP （ ）数据库中对黄芪、莪术成分进行检索；将人体口服生物利用度（ oral bioavailability ， OB ）≥ 30% 、药物相似性（ drug-likeness ， DL ）≥ 0.18 的成分作为潜在活性成分，并结合文献报道，将具有体内外抗癌活性的黄芪、莪术成分补充到潜在活性成分中 [20-21] 。
2.1.4 黄芪、莪术活性成分靶点预测与抗肝癌靶点筛选 在 PubChem （ ）数据库中检索“ 2.1.3 ”项下活性成分的 Isomeric SMILES 数据，将该数据输入 SEA （ ）和 SwissTargetPrediction （ ） 2 个数据库，预测成分靶点，与 TCMSP 数据库中的靶点取并集得到潜在活性成分作用靶点，并在 Uniprot 数据库中对靶点基因名称进行校正，使蛋白质靶点信息标准化 [22] 。将成分作用靶点与“ 2.1.1 ”项下所筛选肝癌靶点取交集，得到黄芪、莪术抗肝癌靶点。
2.1.5 黄芪、莪术抗肝癌关键成分筛选 将“ 2.1.4 ”项下潜在活性成分靶点与“ 2.1.2 ”项下所筛选肝癌关键靶点取交集，采取疾病关键靶点“反向钩钓”关键潜在活性成分的方式，得到黄芪、莪术抗肝癌关键成分及其靶点。
2.1.7 拓扑网络构建与分析 采用 Cytoscape （ version 3.9.1 ）软件构建肝癌关键靶点的 PPI 网络、成分 - 靶点网络、关键成分 - 靶点 - 通路网络。通过 Network Analyzer 插件对关键成分 - 靶点 - 通路网络的拓扑性质做多元化的分析，获取成分、靶点、通路相关介数值。
2.1.8 黄芪、莪术抗肝癌核心成分及其抗肝癌核心靶点筛选 通过 1 种网络贡献指数（ CI ）评价黄芪 - 莪术抗肝癌成分发挥抗肝癌作用的贡献大小 [24] 。
i 为成分的数量； j 为靶点的数量； ωei 为网络节点参数； Aij 为根据 ωei 值确定的亲和力指数； CAi 为黄芪关键成分 - 靶点 - 通路网络中每种抗肝癌成分的介数； CBi 为莪术关键成分 - 靶点 - 通路网络中每种抗肝癌成分的介数， Ci 为每种抗肝癌成分的介数； Pj 为每种靶点的介数，以参数由关键成分 - 靶点 - 通路网络中获得； NEi 为网络中 1 种抗肝癌成分的网络贡献； CI 为抗肝癌成分发挥抗肝癌作用的贡献大小
以“ hepatocellular carcinoma ”和“ liver cancer ”及活性成分的常用名称用作为关键词，检索 1990 — 2018 年出版于 PubMed 和 CNKI 数据库中的相关文献。如果前 N 个成分的 CI 总和超过 50% ，则认为这些相关的 N 个成分对黄芪和莪术发挥抗肝癌作用的贡献最大； CI 总和超过 90% ，则认为这些相关的 N 个成分对黄芪和莪术发挥抗肝癌作用的贡献最主要。核心成分在关键成分 - 靶点 - 通路网络中所调节的介数大于 5 的靶点为抗肝癌核心靶点。
2.1.10 核心基因在肿瘤及正常组织表达量差异分析 在癌症基因组图谱（ cancer genome atlas ， TCGA ）网站中得到核心基因在肿瘤组织及正常组织中的表达量，进行差异表达分析 [25] 。
2.2.1 MTT 实验 将处于对数生长期的 HepG2 和 LO2 细胞分别以 5 000 个 / 孔接种到 96 孔板中，培养 24 h 后，分别给予不同浓度的黄芪皂苷 II 、黄芪甲苷、芒柄花素、莪术醇、姜黄素、双去甲氧基姜黄素，对照组加入不含药物的培养基，同时设置调零孔（不接种细胞），处理 24 、 48 、 72 h ，处理后每孔加入 10 μL MTT （ 5 mg/mL ）， 37 ℃孵育 4 h ；去上清，加入 100 μL DMSO 终止孵育，使用酶标仪测定 570 nm 处的吸光度（ A ）值，计算细胞存活率 。
2.2.2 药物协同作用研究 根据“ 2.2.1 ”项结果，从黄芪、莪术各成分中各选 1 个作用效果最佳的单体，进行药物协同作用研究。细胞存活率的结果通过 Chou-Talalay 模型做多元化的分析，以评价黄芪 - 莪术成分配伍的协同作用，明确最佳协同剂量， CompuSyn 软件采用 Chou-Talalay 模型计算药物组合的组合指数，组合指数＝ 1 为加和效应，组合指数＜ 1 为协同作用，组合指数＞ 1 为拮抗作用 [24] 。
2.2. 4 Western blotting 法检测蛋白表达 选择“ 2.2.2 ”项单体对应的靶点在 Pymol 软件中进行分子对接可视化，并通过 Western blotting 实验验证单体对蛋白表达的影响。分组与给药同“ 2.2.3 ”项，收集药物作用后的 HepG2 细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白，使用 Nanodrop lite 检测蛋白浓度，蛋白样品经 10% 十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至 PVDF 膜，经 5% 脱脂奶粉封闭后，加入一抗， 4 ℃孵育过夜；加入二抗， 37 ℃孵育 2 h ，使用 ECL 化学发光试剂盒显影，采用 Image J 软件分析条带灰度值。
2.2. 5 统计学分析 数据使用 Graphpad Prism 9.5 软件处理，采用单因素方差分析进行组间统计。
对 GSE57957 、 GSE60502 、 GSE84402 肝癌基因表达数据来进行 PCA ，结果显示在 3 个数据集中，肝癌组织与癌旁组织基因表达均能明显区分（图 1-A ～ C ）；进一步 Limma 分析，结果显示在 3 组数据中 DEGs 分别有 353 个（上调 85 个，下调 268 个）、 1 241 个（上调 575 个，下调 666 个）、 1 689 个（上调 1 031 个，下调 658 个，图 1-D ～ F ）；将以上 3 组数据中的 DEGs 取并集，共得到肝癌靶点 2 766 个（图 1-G ）；进一步疾病关键靶点分析，结果显示 PPI 网络中得分最大为 97.33 的 MCODE 功能模块所含有的 112 个靶点为肝癌关键靶点（图 1-H ）。
通过检索 TCMIP 数据库，得到黄芪化学成分 87 种，经筛选潜在活性成分 26 种，其中 OB ≥ 30% 、 DL ≥ 0.18 的成分 20 种（ AR-1 ～ AR-20 ），通过文献补充的成分 6 种（ AR-21 ～ AR-26 ）；得到莪术化学成分 81 种，经筛选潜在活性成分 13 种，其 中 OB ≥ 30% 、 DL ≥ 0.18 的成分 3 种（ CR-1 ～ CR-3 ），通过文献补充的成分 10 种（ CR-4 ～ CR-13 ），黄芪与莪术共有成分 1 种（常春藤皂苷元），共得到黄芪 - 莪术药对潜在活性成分 38 种（表 1 ）。
分别对黄芪 166 个靶点、莪术 103 个靶点进行 KEGG 富集分析，根据包含靶点数量筛选排名前 20 的通路，结果显示，黄芪与莪术所调节的 20 条通路中，共有通路有 9 条；其中黄芪中排名前 5 位的通路分别为代谢途径、癌症的通路、神经活性配体 - 受 体相互作用、磷脂酰肌醇 3- 激酶（ phosphatidylinositol 3-kinase ， PI3K ） - 蛋白激酶 B （ protein kinase B ， Akt ）信号通路、细胞周期，莪术中排名前 5 位的通路分别为代谢途径、癌症的通路、类固醇激素生物合成、胆汁分泌、化学致癌（图 2-B ）。
通过肝癌关键靶点进行“反向钩钓”，得到黄芪 - 莪术抗肝癌关键成分 29 种，其中黄芪抗肝癌关键成分 22 种、莪术抗肝癌关键成分 8 种，两者共有抗肝癌关键成分 1 种（常春藤皂苷元，图 3-A ）。 29 种黄芪 - 莪术抗肝癌关键成分所调节抗肝癌关键靶点 15 个，对以上靶点进行 KEGG 富集分析，共得到 17 条通路，其中最重要的细胞过程包含细胞周期、细胞衰老、 p53 信号通路、卵母细胞减数分裂、细胞凋亡 - 多个物种共 5 条信号通路（图 3-B ）。
通过网络贡献指数模型，计算黄芪 - 莪术抗肝癌 29 种关键成分的抗肝癌作用贡献指数。根据计算结果， CI 值合计为 55.67% 的前 6 种成分均为黄芪成分，表明其抗肿瘤作用贡献最大； CI 值合计为 90.64% 的前 17 种成分中莪术成分有 2 种，在某些特定的程度上表明黄芪 - 莪术配伍发挥协同抗肿瘤作用（图 4-A ）。根据成分 CI 值及其所在中药中的相对特异性，选取黄芪中的黄芪皂苷 II 、黄芪甲苷、芒柄花素与莪术中的莪术醇、姜黄素、双去甲氧基姜黄素共 6 种成分作为黄芪 - 莪术药对的核心代表性成分，与之相对应的 CDK1 、 DNA 拓扑异构酶 2A （ topoisomerase 2A ， TOP2A ）、极光激酶 B （ aurora B ， AURKB ）、检查点蛋白激酶 1 （ check point kinase 1 ， CHEK1 ）、 AURKA 共 5 个靶点为核心靶点。对分子对接得分进行热图分析，结果显示 CDK1 与这 6 个核心成分均有较好的结合活性（结合能均＜ − 5 kJ/moL ，图 4-B ）。将上述 5 个靶点在肿瘤组织与正常组织之间的表达量差异做多元化的分析，结果显示以上 5 个靶点在肝癌组织及正常组织中的表达均有较大差异（图 4-C ）。
为了评价黄芪 - 莪术药对成分配伍的体外抗肿瘤协同作用，选择双去甲氧基姜黄素和黄芪皂苷 II 进行协同作用研究，通过 Chou-Talalay 数学模型进行协同作用效果评价 [27] 。结果如图 6 所示，与单独药物作用相比，联合组的细胞活力明显降低（ P ＜ 0.05 、 0.01 ）。为了查明该组合是否起到加和作用或协同作用，使用 CompuSyn 软件进一步分析细胞活性数据，根据结果得出各浓度的双去甲氧基姜黄素和黄芪皂苷 II 在中位有效剂量（组合指数＜ 1 ）时均表现出协同作用，其最佳协同剂量为 0.625 μmol/L 黄芪皂苷 II 和 0.625 μmol/L 双去甲氧基姜黄素。
细胞周期检测结果为，黄芪皂苷 II （ 5 μmol/L ）和双去甲氧基姜黄素（ 5 μmol/L ）以及联合给药（黄芪皂苷 II 2.5 μmol/L ＋双去甲氧基姜黄素 2.5 μmol/L ）处理 HepG2 细胞 24 h 后可导致细胞周期异常。如图 7 所示，与对照组比较，不同组别药物处理 HepG2 细胞 24 h 后，各组 G2/M 期的细胞比例 均升高。与单用黄芪皂苷 II 和双去甲氧基姜黄素组相比，联合组 G2/M 期细胞比例非常明显升高（ P ＜ 0.01 ），上述结果提示黄芪皂苷 II 与双去甲氧基姜黄素均能诱导 HepG2 细胞周期停滞于 G2/M 期，且联用效果更佳（ P ＜ 0.01 ）。
古今医家多认为正气亏虚为肝癌的发病内因和前提，瘀血凝滞是肝癌发病的基本病理因素，正气不足、瘀血阻滞始终伴随着肝癌的发生、发展和转移[28] 。因此临床治疗肝癌常将黄芪、莪术等益气药与活血药配伍使用，不仅可辅助正气，同时能行气活血，两者兼顾，共凑扶正祛邪之效[11-13,29-30] 。
本研究利用生物信息学结合网络药理学与分子对接技术探究黄芪- 莪术药对治疗肝癌的活性成分、潜在靶点和信号通路，进而揭示其配伍机制。结果为，黄芪- 莪术抗肝癌活性成分33 种，其中黄芪22 种、莪术12 种、两者共有成分1 种；对应抗肝癌靶点180 个，其中黄芪调节77 个、莪术调节14 个、两者共同调节89 个；KEGG 通路富集分析显示黄芪- 莪术药对调节抗肝癌通路31 条，其中黄芪调节20 条、莪术调节20 条、共同调节9 条。以上结果从成分、靶点、通路3 个方面揭示了黄芪、莪术配伍协同抗肝癌的科学内涵。
KEGG 通路结果显示黄芪- 莪术药对主要是通过细胞周期、细胞衰老、p53 信号通路、细胞凋亡、代谢通路等发挥抗肝癌作用。其中细胞周期、p53 信号通路是与肿瘤发生发展紧密关联的信号通路，在调控肝癌细胞周期、增殖、凋亡、细胞代谢等行为上发挥及其重要的作用。p53 作为一种转录因子，通过调节其下游基因的表达来调控细胞周期阻滞、细胞衰老、DNA 修复和细胞凋亡等过程，p53 缺失不仅会引起细胞分裂的增加和细胞存活率的提高，还会引起更具侵袭性的行为和基因组不稳定性的增加[31] 。p53 下游靶蛋白p21 和CDK2 调控细胞周期的进行，CDK2 与CCNA 、CCNE 相互作用可使Rb 蛋白磷酸化，从而促进细胞从G1 期进入S 期，p21 能抑制其相互作用从而抑制细胞周期进程[32-33] 。
经筛选得到的 6 个核心成分（黄芪甲苷、黄芪皂苷 II 、芒柄花素、姜黄素、双去甲氧基姜黄素、莪术醇），均具有不一样程度的抗肿瘤作用，其调控的5 个核心基因（CDK1 、CHEK1 、TOP2A 、AURKA 、AURKB ），在肿瘤发生发展过程中同样具备极其重大的调控作用。研究表明，AURK 是一类丝/ 苏氨酸激酶，能够最终靠干扰中心体、纺锤体以及染色体的功能影响细胞的有丝分裂，AURKA 调节有丝分裂早期中心体成熟，参与建立双极纺锤体，其功能的有效发挥离不开周期蛋白B 与CDK 复合物（cyclin B-CDK1 ）的正常作用，活化的cyclin B-CDK1 可以使蛋白磷酸酶1 （protein phosphatase 1 ，PP1 ）失活，PP1 能抑制AURKA 活性[34] 。CDK1 是调控细胞周期的关键蛋白，CHEK1 为调控CDK 蛋白的上游蛋白，CHEK1 的磷酸化能够导致细胞分裂周期因子25A/C （cell division cyclin 25A/C ，CDC25A/C ）的磷酸化失活，从而抑制CDK1 进入有丝分裂G2/M 期[35] 。分子对接结果为核心成分（黄芪甲苷、黄芪皂苷 II 、芒柄花素、姜黄素、双去甲氧基姜黄素、莪术醇）与核心靶点（CDK1 、CHEK1 、TOP2A 、AURKB 、AURKA ）结合能较强，有几率存在较好的结合活性。研究之后发现，芒柄花素通过环氧合酶-2/ CCND 轴将人肝癌Bel-7402 细胞和HepG2 细胞阻滞于G0/G1 期[36-37] ；莪术醇可以阻滞HepG2 细胞于G1 期[38] ；黄芪甲苷能够上调具有低转移潜能和高转移潜能的人肝癌Huh7 细胞和人肝癌MHCC97-H 细胞中E- 钙黏蛋白的蛋白水平并促进其在细胞膜上积累，使得细胞间连接更加紧密以此来降低转移扩散能力；姜黄素可以通过激活Huh7 细胞内死亡受体介导的通路诱导凋亡[39] ；且黄芪甲苷与姜黄素联用对血管生长因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF ）、基质金属蛋白酶2 （matrix metallopeptidase 2 ，MMP2 ）、成纤维细胞生长因子-2 （fibroblast growth factor-2 ，FGF-2 ）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor ，HGF ）以及血栓形成相关因子组织因子（tissue factor ，TF ）和凝血因子 VII 有协同抑制作用[40] 。
通过体外细胞实验验证了黄芪 - 莪术药对6 个核心成分对HepG2 细胞的增殖均有着非常明显的抑制作用。协同作用分析结果为，黄芪中的黄芪皂苷 II 和莪术中的双去甲氧基姜黄素配伍有协同作用，其最佳协同剂量为黄芪皂苷 II 0.625 μmol/L 、双去甲氧基姜黄素0.625 μmol/L 。2 个成分配伍使用可协同增效抑制周期调控蛋白CDK1 和CCNB1 的表达，进而诱导HepG2 细胞停滞于G2/M 期。
本研究基于生物信息学数据，结合网络药理学方法与分子对接技术及细胞实验证明了黄芪、莪术配伍可以通过多成分、多靶点、多通路在肝癌治疗中发挥协同作用，为更准确寻找、确认和优化黄芪、莪术发挥抗肝癌效应的有效成分与靶点的作用，推动临床应用提供新的见解。
来 源：鲍 宁，陈子超，刘名玉，赵春芹，李 肖，张 振．整合生物信息学与实验验证解析黄芪-莪术药对抗肝癌配伍机制 [J]. 中草药, 2024, 55(1): 114-126.
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